小鼠生化位點(diǎn)檢測(cè)

乙酸纖維薄膜電泳是生物化學(xué)的方法，該技術(shù)運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制只有二十余年的歷史。由于該方法能檢查近20對(duì)等位基因，涉及十幾條染色體，利于反映被檢品系的遺傳概貌，所以，目前認(rèn)為此法靈敏度高，準(zhǔn)確性強(qiáng)，檢出速度快，用樣量小，是遺傳檢測(cè)諸方法中較為理想的一種。

一、實(shí)驗(yàn)器材

1．樣品

(1)血清：用于Es-1和Trf兩位點(diǎn)檢查。

(2)溶血清：用于檢查Hbb、Car-2和Ldr-1位點(diǎn)。

(3)腎勻漿：用于檢查Es-2、Es-3、Idh-1、Mod-1、Akp-1、Pgm-1、Pep-1、Gpd-1、Gpi-1、Ce-2位點(diǎn)。

(4)尿液：一般在早上8～9時(shí)取鼠原尿，做一倍稀釋后方可使用，用于Mup-1位點(diǎn)的檢查。

2．緩沖液：略。

3．染色液：略。

4．點(diǎn)樣品一套，電泳儀一臺(tái)，電泳槽一個(gè)，乙酸纖維薄膜若干張。

5．滴管、管架、直徑10cm培養(yǎng)皿、普通濾紙、燒杯各二個(gè)。

二、實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1．實(shí)驗(yàn)方法

我們采用的是水平乙酸纖維薄膜電泳法即用普通濾紙做鹽橋，在低溫常壓下的電泳。

2．實(shí)驗(yàn)步驟

(1)把電泳緩沖液加入電泳槽內(nèi)到紅線位置，鹽橋?yàn)V紙對(duì)折后用訂書(shū)機(jī)將其同定在橋架上，然后加蓋置于4℃冰箱或相應(yīng)冷室里預(yù)冷。

(2)從低溫(-20℃)冰箱中取出樣品，于室溫下自然解凍，并同時(shí)將乙酸纖維薄膜裁成適當(dāng)大小投入緩沖液中浸泡濕透。

(3)從緩沖液中取出乙酸纖維薄膜夾于兩張普通濾紙間，用手輕壓濾紙，以吸去薄膜上的多余緩沖液。

(4)樣品解凍后，用彎頭滴管吸取少量樣品液于點(diǎn)樣板上的小方格內(nèi)，并依序記下樣品號(hào)碼，再用點(diǎn)樣刷蘸取適量樣品液點(diǎn)在乙酸纖維薄膜粗糙面距邊緣1.5cm處，之后迅速轉(zhuǎn)入電泳槽內(nèi)，按規(guī)定方向(緩沖液pH值大于5.6的，樣品的電泳方向是由負(fù)極向正極泳動(dòng)，若pH值小于或等于5.6則由正極向負(fù)極泳動(dòng))把點(diǎn)上樣的薄膜水平搭在鹽橋上，待調(diào)整好位置后加蓋飽和1～2min，接通電泳，選擇適當(dāng)電壓和電流并按規(guī)定時(shí)間電泳。

(5)時(shí)間到后立即將電壓電流選擇調(diào)零和關(guān)掉電源，依次取出走完的乙酸纖維薄膜，放入相應(yīng)的染色液中，染色5min后取出于5％乙酸溶液脫色1～2h，或直到電泳帶背影清楚為止，自然風(fēng)干后，照相或透明等處理，易于長(zhǎng)期保存。

三、結(jié)果分析

結(jié)果分析指的是電泳帶型的確定。我們知道，每個(gè)品系都有自己固定的電泳帶型，這個(gè)原始的固定電泳帶型稱作該品系的標(biāo)準(zhǔn)型。品系間各位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)型有的相同，有的則不同；而品系間生化位點(diǎn)的標(biāo)志相異對(duì)于電泳帶型的確定是很有用的。在實(shí)際工作中，由于DBA／2和C57BL兩品系小鼠的多數(shù)生化位點(diǎn)標(biāo)志都不相同，故在生化位點(diǎn)檢查時(shí)將其用作確定待知鼠電泳帶型的參照物來(lái)使用。

一般在電泳時(shí)，總是把待測(cè)樣品和已知標(biāo)準(zhǔn)型樣品在同樣條件和同一支持物上走電泳的，這樣待測(cè)作品就可與標(biāo)準(zhǔn)型樣品的帶型進(jìn)行對(duì)比了，以此即可確定待測(cè)樣品的帶型。例如我們把特測(cè)樣品和已知標(biāo)準(zhǔn)的DBA／2和C57BL品系的樣品同時(shí)走Car-2電泳，其待測(cè)帶型如果跟DBA／2一樣則為b型，若和C57BL的一樣就是a型，要是即同DBA／2，又同C57BL，那么它就是混雜帶型。

注意：對(duì)于一個(gè)單位來(lái)講，*次檢查應(yīng)該是的，特別是新引進(jìn)的或新培育的品系更應(yīng)如此。但如果這個(gè)單位已進(jìn)行過(guò)一次檢測(cè)后，隔一段時(shí)間。要對(duì)已查過(guò)的品系進(jìn)行再?gòu)?fù)查時(shí)，若做生化位點(diǎn)檢測(cè)，可只測(cè)臨界位點(diǎn)，即Car-2、MuP-1、Hbb、Es-1、Trf和Es-3。這樣可節(jié)省人力和物力。